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推荐升级替代产品：实时可调易错PCR试剂盒(染料法)

易错PCR（Error-prone PCR）是利用Taq DNA多聚酶不具有3'→5'校对功能的特性，在一定条件下（如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在）能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。本制品是在本公司的易错PCR试剂盒的基础上改进而得。

• 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
  
• 配方经过精心优化，实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2～8突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
  
• 可用于连续易错PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
  
• 可以扩增的DNA片段更长，达到2kb，对于2kb以上的产物，建议分段扩增。
  
• 本试剂盒足够100次30μL体系的易错PCR。
  
• 本制品只能用于科研。

• 将引物稀释到10μM。引物也是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25～30nt之间，GC含量在45%～60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
  
• 用自备易错PCR引物和自备的常规PCR试剂扩增制备易错DNA模板（常规PCR产物），胶回收并准确确定浓度。注意：易错PCR的模板一定要用胶回收的常规PCR产物，因为胶回收会可以把电泳不可见的非特异性扩增片段去除，否则这些片段由于也是用易错PCR引物扩增所得，在易错PCR扩增时也会被扩增，产生竞争抑制，降低靶分子的扩增效率。
  
• 将回收的DNA片段（模板）稀释到1ng/μL、10ng/μL和100ng/μL三个浓度。
  注意：模板使用量是影响突变率的最重要因素，模板DNA为非突变DNA，扩增产生的DNA为突变DNA，易错PCR体系最终DNA量是基本固定的，因此模板DNA使用量越大，则突变DNA在终产物中的相对比例就越低，突变率就越低。故建议同时测试三个模板用量。如果都成功，则优先选用模板浓度低的PCR产物进行分析。
  
• 根据每1000bp的预期突变数按下表确定30μL易错PCR体系中MnCl2和dGTP的用量（这是在模板DNA不超过1ng的前提下的数据）。表中的Mn表示可调易错PCR专用的MnCl2,dG表示可调易错PCR专用的dGTP：
  

  预期突变数	2个	3个	4个	5个	6个	7个	8个
  Mn用量(μL)	0	1.0	2.5	4.0	4.0	4.0	4.0
  dG用量(μL)	0	0	0	1.0	2.0	3.0	4.0

• 设置30μL体系的可调易错PCR：第一次建议设置3个模板浓度。在3干净的PCR管中，分别加入下列成分。最后加可调易错PCR专用MnCl2：
  

  成分	模板用量1	模板用量2	模板用量3
  可调易错PCR Mix,5×	6μL
  可调易错	PCR专用dGTP根据上步用量表表选择
  自备DNA模板	1μL(1ng/μL)	1μL(10ng/μL)	1μL（100ng/μL)
  自备PCR引物(10μM each)	1μL each
  可调易错PCR专用Taq DNA聚合酶	0.5μL
  可调易错PCR专用MnCl2	根据上步用量表表选择
  自备超纯水	至30μL

• 按已经优化的常规PCR条件进行易错PCR：
  

  过程	温度	时间	循环数
  PCR前变性	94℃	3分钟	1
  易错PCR	94℃	1分钟	30-60
  	60℃	1分钟
  	72℃	3～10分钟

  • 由于易错PCR含高浓度的镁离子，因此容易形成引物二聚体，因此需要使用较高的复性温度，以避免小片段扩增产物竞争性抑制PCR。易错PCR一般不需要热启动，也不需要在易错PCR结束后做延伸处理。易错PCR循环次数越多，突变DNA（扩增产物）与非突变DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突变率和模板长度恒定的情况下，扩增次数越多，发生突变的绝对数就越高，在同一模板上发生的突变位点数就越多，所以如果需要，可以做30、35、40、45、50、55、60次7个循环数的比较。
• 易错PCR结束后，取3μL进行电泳检查。
  
• 如果有预期大小的PCR产物，则全部电泳，进行胶回收，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮易错PCR。
  
• 如果没有预期大小的PCR产物，可以按下列操作追加进行一轮常规PCR（追加PCR）。
  
• 在PCR管中，加入3μL 10×可调易错PCR专用追加dNTP到27μL电泳剩下的PCR体系中，按下表进行追加PCR（chasing PCR）。
  

  步骤	温度	时间	循环数
  追加PCR	94℃	1分钟	20
  	60℃	1分钟
  	72℃	1分钟

  • 追加PCR只做20次循环。
• 追加PCR结束后，再电泳检测。如果有条带，再进行克隆和测序等后续操作。如果需要增加突变率，可以选择一个突变后的DNA为模板，再进行下一轮易错PCR。
  
• 如果没有预期大小的PCR产物，则需要分析原因。

• 没有PCR产物。
  
  • 引物没有优化，可以重新设计引物；
    
  • 模板DNA太少，可以增加用量；
    
  • 模板不纯，最好先胶回收；
    
  • DNA溶液中有EDTA，可以适当补加Mg²⁺。
• 太多的PCR条带或PCR条带模糊一片。
  
  • 模板有胶回收
    
  • PCR循环数太多
    
  • 复性温度太低
    
  • 引物没有优化；
    
  • PCR条件没优化，可以使用touch-down PCR。
• 如果需要更高的突变率，如何办？
  可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但最好先用胶纯化回收易错PCR片段，再用于下一轮易错PCR。